[要約]

このページでは、安定同位体である15N標識をしたアミノ酸を糖タンパク質の化学合成に利用し、糖タンパク質の動的挙動を解析したことについて述べる。

CDF

オリゴ糖が糖タンパク質に及ぼす影響を明らかにするために、Hienらは複合型および高マンノース型オリゴ糖を持つフラクタルカイン（CDF）を合成した（図9：CDFの全合成と15N-同位体濃度の特異的勾配を用いた構造解析）[28]。さらに、15N-同位体濃度を可変して特定のアミノ酸を標識する方法（Specific and Gradient 15N-isotope-labeling method：SGI）を用いて糖タンパク質の構造解析を行った。安定同位体標識の濃度を変えてアミノ酸をタンパク質に導入することで、同じアミノ酸であっても区別し観測することができることが特徴である。CDFは76個のアミノ酸からなり、Asn9にN-結合型糖鎖を持つ。この合成では、標準的なFmocまたはBocプロトコールでそれぞれ複合型非糖と高マンノース型糖を持つ糖ペプチドチオエステル81を合成した。次に、4つのセグメント80-83をNCLで順次カップリングさせた後、脱保護を行った。最後に、Acm保護基を脱保護して全長の糖ペプチドを得た。酸化的フォールディングプロセスの結果、13個の15N標識アミノ酸が特定の位置に挿入されたハイマンノース型または複合型糖鎖を持つ2種類の糖鎖CDF 85が得られた。また、同じ方法で非グリコシルCDFも合成した。CDスペクトルとジスルフィド結合の位置を特定する分析をしたところ、グリコシル化CDF 85と非グリコシル化CDFの両方が正しい３次構造を形成していることが確認された。SGI標識法により、1H-15N HSQCスペクトルに特定のアミノ酸を割り当てることができ、3つの合成CDFの局所的なコンフォメーション特性のダイナミクスを調べることができた。HSQCにTOCSYとNOESYを組み合わせた方法によると、グリコシル化は室温でのCDFのコンフォメーション変化に影響を与えなかった。しかしながら、T1値は糖鎖モチーフが局所的なコンフォメーションにおけるダイナミクスに影響を与えることを示していた。その結果、温度によって変化する円偏光二色性CDスペクトルとT1値は、オリゴ糖がタンパク質の揺らぎを抑制し、タンパク質の構造を安定化する可能性を示した。

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