研究成果 -Reserch-


最新の研究成果

シアリル糖ペプチドチオエステル調製

EPOやインターフェロンβなどの生理活性糖タンパク質は、シアル酸を末端に有した糖鎖(シアリル糖鎖)が結合した状態で機能発現することが知られており、シアリル糖鎖を有した糖タンパク質の合成法の確立は非常に重要なものでした。ですが、シアル酸と他の糖残基との結合であるシアリル結合は酸性条件下で容易に分解されることが知られていました。




Figure 8. A property of sialyl linkage and selective protections to the complex type oligosaccharide

 我々は、その原因がシアル酸のカルボキシル基の水素が、図8-aのように分子内触媒として働くことが不安定性の原因であると考えました。これは、図8-bの1963年に報告されていたグルコース誘導体の加水分解速度を比較した際に、分子内に触媒水素を持つ化合物が非常に早い加水分解を受けたことからヒントを得ました。そこで、図8-cのルートで、Fmocシアリル複合型糖鎖アスパラギンを原料に、シアル酸のカルボン酸をフェナシル基で保護し、また、ペプチド合成の際に必要な保護基であるBoc基を主鎖アミノ基に導入した糖鎖を有機合成で得ました。
 得られたフェナシル基で保護された糖鎖は、強酸性条件下(TFA、TfOH)でもシアル酸部分が分解されず安定に存在することがわかりました。




Figure 9. Chemical synthesis of sialylglycopeptide –thioester by Boc SPPS

 この酸性条件下で安定に存在できる糖鎖を用いて、シアリル糖ペプチドチオエステル体の合成手法を見出しました。この新しい合成法では、まずチオール基を連結させた固相(樹脂)に対して、一般的なBocペプチド固相合成法の条件にてペプチド鎖の伸長をおこないました。この合成の途中で、図8-cのルートで合成したフェナシル基で保護された糖鎖アスパラギン誘導体を縮合反応に用いることで、目的とするアミノ酸配列を有するシアリル糖ペプチドチオエステル体を固相上に構築します。この後、氷冷下でTfOHを含む酸性溶液によりペプチドの側鎖の脱保護をおこないます。この際、側鎖が遊離となったシアリル糖ペプチドチオエステル体は、固相とアミド結合で連結されているため、酸加水分解されずに固相上に残ることになります。よって、この手法では脱保護反応に用いたTfOH溶液や脱保護されたペプチド側鎖の保護基は、溶媒で洗浄するだけで除去することができ、用いた酸等の留去が不要になるため、安全且つ簡便な合成が可能となりました。脱保護反応後は、アルキルチオールを含むリン酸緩衝溶媒下、チオエステル交換によるシアリル糖ペプチドチオエステル体を固相から遊離させ、目的化合物を得ることができるようになりました。
 この手法が確立したことで、糖タンパク質合成に欠かせない糖ペプチドチオエステルを得ることができるようになりました。2012年にはこの手法を用いて、2分枝シアリル糖鎖を持つ糖タンパク質EPOの合成に成功しております。

 

IFN-β(糖タンパク質合成例)




Figure 10. Chemical synthesis of sialylglycoprotein (Interferon β)

 また、当研究室と糖鎖工学研究所との共同研究によりFmoc固相合成法を用いたシアリル糖タンパク質(インターフェロンベータ;IFN-β)の合成に成功しております。
IFN-βは、抗ウイルス作用を持つ、サイトカインの一種です。166残基のアミノ酸からなり、80番目のアスパラギン残基にN結合型糖鎖を有しています。
IFN-βの全合成を行うために、全長をN末端のペプチドセグメント(1-67)、末端のシアル酸にベンジル保護を有する糖鎖を持つシアリル糖ペプチドセグメント(68-88)、C末端のペプチドセグメント(89-166)の3つのセグメントに分け、各セグメントをFmoc固相合成法によって調整しました。
 各セグメントをNCLによって連結後、連結部位の脱硫化を行います。システイン残基のAcm基の脱保護と、シアル酸のベンジル基の脱保護を行った後、フォールディング操作を行い、シアリル糖タンパク質IFN-βを得ることに成功しました。
この化学合成によって得られた糖タンパク質IFN-βは、in vivoにおいて活性を示しました。 これは、化学合成によって得られた糖タンパク質がin vivoでの活性を示した初めての例です。

 

ハイマンノース型糖鎖を持つIL-8を用いた解析




Figure 11. A Unique approach for the study of glycoprotein quality control

糖タンパク質品質管理機構を調べるためには、ミスフォールド糖タンパク質プローブが必要です。私たちの研究室では、M9-Interleukin 8という糖タンパク質を用いて、天然型の立体構造を持つ糖タンパク質(ネイティブ体,6)とジスルフィド結合のかけ違いによる天然型の立体構造をとれていない糖タンパク質(ミスフォールド体,7, 8, 9)の合成に成功しています
。 (a) これら4種類の糖タンパク質を用いて、フォールディングセンサーであるUGGTによるグルコース転移を調べました。(b) (b)のグラフより、ネイティブ体6はUGGTによるグルコース転移は見られず、ミスフォールド体7, 9は転移がみられることから、UGGTは天然型の糖タンパク質の構造とそうでない構造を識別していることがわかります。さらに、ミスフォールド体7, 9の間でもグルコース転移量に差があることから、ミスフォールド体の構造も識別していることが新たに明らかになりました。ミスフォールド体のそれぞれの構造は、ANSというタンパク質の疎水性表面を認識する蛍光物質により、糖タンパク質の疎水性表面の露出とUGGTの認識が関連している可能性が示唆されました。私たちは、このように構造の違う糖タンパク質を用いて、品質管理機構に関わる酵素の分子レベルでの認識機構解明を目指しています。

 

新規C末端活性ペプチド、ペプチドグアニジド体の話




Figure 12. A synthetic spproach to a peptide-thioester from an unprotected peptide

現在当研究室では、新規C末端活性ペプチド、ペプチドグアニジド体に着目し、研究を進めています。ペプチドグアニジド体はペプチドC末端にグアニジド基を有するペプチドです。グアニジド基は、システインにチオノホルミル基を導入し、その後グアニジンを加えることで導入されます。ペプチドグアニジド体は、容易にペプチドチオエステルに交換される性質や、チオエステル体よりもはるかに脱離能が低いといった性質を有するため、前途のNCLの応用であるKCL(Kinetically Controlled Ligation)などのペプチド連結反応への応用が期待されています。

 


 

 

Selected papers concerned with glycoprotein and oligosaccharide syntheses.

  1. R. Okamoto, M. Kimura, T. Ishimizu, M. Izumi, Y. Kajihara. Semisynthesis of a Post-Translationally Modified Protein by Using Chemical Cleavage and Activation of an Expressed Fusion Polypeptide. Chem. Eur. J. 2014, 20, 10425-10430.

  2. R. Okamoto, K. Mandal, M. R. Sawaya, Y. Kajihara, T.O. Yeates, S. B.H. Kent (Quasi-)Racemic X-ray Structures of Glycosylated and Non-Glycosylated Forms of the Chemokine Ser-CCL1 Prepared by Total Chemical Synthesis. Angew. Chem. Int. Ed. 2014, 53(20), 5194-5198

  3. R. Okamoto, K. Mandal, M. Ling, A. D. Luster, Y. Kajihara, S. B. H. Kent. Total chemical synthesis and biological activities of glycosylated and non-glycosylated forms of the chemokines CCL1 and Ser-CCL1. Angew. Chem. Int. Ed. 2014, 53(20), 5188-5193

  4. S. Dedola, M. Izumi, Y. Makimura, A. Seko, A. Kanamori, M. Sakono, Y. Ito, Y. Kajihara, Folding of Synthetic Homogeneous Glycoproteins in the Presence of a Glycoprotein Folding Sensor Enzyme. Angew. Chem., Int. Ed. 2014, 53, 2883-2887.

  5. C. Unverzagt, Y. Kajihara, Chemical assembly of N-glycoproteins: a refined toolbox to address a ubiquitous posttranslational modification, Chem. Soc. Rev., 2013, 42, 4408-4420. DOI:10.1039/c3cs35485g.

  6. M.Izumi, Y. Makimura, S. Dedola, A. Seko, A. Kanamori, M. Sakono, Y. Ito,Y. Kajihara. Chemical Synthesis of intentionally Misfolded homogeneous Glycoprotein: a unique approach for the study of glycoprotein quality control.
    J. Am. Chem. Soc.
    ,2012, 134, 7238-7241.

  7. I. Sakamoto, K. Tezuka, K.Fukae, K. Ishii,.K. Taduru, M. Maeda, M. Ouchi, K. Yoshida, Y. Nambu, J. Igarashi, N. Hayashi, T. Tsuji, Y. Kajihara, Chemical Synthesis of homogeneous glycosyl-interferon-β that exhibits potent antitumor activity in vivo. J. Am. Chem. Soc., 2012, 134, 5428-5431. This paper is selected for JACS Spotlights as Chemically Stitching Designer Protein Drugs.

  8. M. Murakami, R. Okamoto, M. Izumi, Y. Kajihara, Chemical Synthesis of an Erythropoietin Glycoform Containing a Complex-type Disialyloligosaccharide. Angew. Chem. Int. Ed. 2012, 51, 3567-3572. This paper was selected for inside cover as well as very important paper.

  9. R. Okamoto, K. Morooka, Y. Kajihara, A synthetic approach to a peptide alpha-thioester from unprotected peptide through cleavage and activation of a specific peptide bond by N-acetylguanidine, Angew. Chem. Int. Ed. (2012), 51, 191-196. DOI: 10.1002/anie.201105601.

  10. Y. Kajihara, Y. Tanabe, S. Sasaoka, R. Okamoto, Homogeneous human complex type oligosaccharides in correctly folded intact glycoproteins: evaluation of the oligosaccharide influence on protein-folding, -stability, and -conformational properties. Chem. Eur. J. 2012, 18, 5944-5953.

  11. K. Hirano, D. Macmillan, K. Tezuka, T. Tsuji, Y. Kajihara Design and Synthesis of Homogeneous Erythropoietin Analogue with Two Human Complex-Type Sialyloligosaccharides: Combined Use of Chemical and Bacterial Protein Expression Methods. Angew. Chem. Int. Ed., (2009), 48,9557-9560. Selected for Inside cover as well as hot paper.

  12. R. Okamoto, Y. Kajihara; Uncovering latent ligation site for glycopeptide synthesis. Angew. Chem. Int. Ed. (2008), 47(29), 5402-5406.

  13. Y. Kajihara, Y. Suzuki, N. Yamamoto, K. Sasaki, T. Sakakibara, L. R. Juneja; Prompt chemo-enzymatic synthesis of diverse complex-type oligosaccharides and its application to the solid-phase synthesis of a glycopeptide with Asn-linked sialyl-undeca- and asialo-nona-saccharides. Chem. Eur. J. (2004), 10(4), 971-985.

  14. N. Yamamoto, Y. Tanabe, R. Okamoto, P. E. Dawson, Y. Kajihara; Chemical Synthesis of a Glycoprotein Having an Intact Human Complex-Type Sialyloligosaccharide under the Boc and Fmoc Synthetic Strategies. J. Am. Chem. Soc. (2008), 130(2), 501-510.

  15. N. Yamamoto, Y. Ohmori, T. Sakakibara, K. Sasaki, L. R. Juneja, Y. Kajihara; Solid-phase synthesis of sialylglycopeptides through selective esterification of the sialic acid residues of an Asn-linked complex-type sialyloligosaccharide. Angew. Chem. Int. Ed. (2003), 42(22), 2537-2540.

  16. T. Miyazaki, H. Sato, T. Sakakibara, Y. Kajihara; An Approach to the Precise Chemoenzymatic Synthesis of 13C-Labeled Sialyloligosaccharide on an Intact Glycoprotein: A Novel One-Pot [3-13C]-Labeling Method for Sialic Acid Analogues by Control of the Reversible Aldolase Reaction, Enzymatic Synthesis of [3-13C]-NeuAc- α -(2→ 3)-[U-13C]-Gal-β -(1→ 4)-GlcNAc-β - Sequence onto Glycoprotein, and Its Conformational Analysis by Developed NMR Techniques. J. Am. Chem. Soc. (2000), 122(24), 5678-5694. 

  17. T. Miyazaki, T. Sakakibara, H. Sato, Y. Kajihara; Chemoenzymic Synthesis of the 9-Deoxy-9-fluoro-[3-13C]-NeuAc- α -(2→ 6)-[U-13C]-β -Gal Sequence on an Intact Glycoprotein. J. Am. Chem. Soc. (1999), 121(6), 1411-1412.

  18. Y. Kajihara, T. Ebata, H. Kodama; Synthesis of immobilized CMP-sialic acids and their enzymic transfer with sialyltransferase. Angew. Chem. Int. Ed. (1998), 37(22), 3166-3169.

  19. R. Okamoto, S. Souma, Y. Kajihara; Efficient Substitution Reaction from Cysteine to the Serine Residue of Glycosylated Polypeptide: Repetitive Peptide Segment Ligation Strategy and the Synthesis of Glycosylated Tetracontapeptide Having Acid Labile Sialyl-TN Antigens. J. Org. Chem. (2009), 74 , 2494 –2501.

  20. R. Okamoto, S. Souma, Y. Kajihara; Efficient Synthesis of MUC4 Sialylglycopeptide through the New Sialylation Using 5-Acetamido-Neuraminamide Donors. J. Org. Chem. (2008), 73(9), 3460-3466.

  21. N. Yamamoto, A. Takayanagi, A. Yoshino, T. Sakakibara, Y. Kajihara; An approach for a synthesis of asparagine-linked sialylglycopeptides having intact and homogeneous complex-type undecadisialyloligosaccharides. Chem. Eur. J. (2007), 13(2), 613-625.

  22. Y. Kajihara, T. Yamamoto, H. Nagae, M. Nakashizuka, T. Sakakibara, I. Terada; A Novel α -2,6-Sialyltransferase: Transfer of Sialic Acid to Fucosyl and Sialyl Trisaccharides. J. Org. Chem. (1996), 61(24), 8632-8635.

  23. Y. Kajihara, T. Ebata, K. Koseki, H. Kodama, H. Matsushita, H. Hashimoto; Efficient Chemical Synthesis of CMP-Neu5Ac and CMP-(Neu5Ac α 2→ 8Neu5Ac). J. Org. Chem. (1995), 60(17), 5732-5735.

  24. Y. Kajihara, N. Yamamoto, R. Okamoto, K. Hirano, T. Murase. Chemical synthesis of homogeneous glycopeptides and glycoproteins. Chemical Record, 2010, 10, 80-100.

  25. T. Murase, Y. Kajihara, Synthesis of the glycosylated polypeptide chain of an inducible costimulator on T-cells, Carbohydr. Res. (2010), 345(10), 1324-1330.

  26. K. Hirano, Y. Kajihara, Synthesis of Heavily Glycosylated Peptide α-Thioester, J. Carbohydr.Chem. (2010), 29(2), 84-91.

  27. T. Murase, T. Tsuji, Y. Kajihara; Efficient and systematic synthesis of a small glycoconjugate library having human complex type oligosaccharides Carbohydr. Res., 344, (2009), 762-770.

  28. Y. Kajihara, A. Yoshihara, K. Hirano, N. Yamamoto; Convenient synthesis of a sialylglycopeptide-thioester having an intact and homogeneous complex-type disialyl-oligosaccharide. Carbohydr. Res. (2006), 341(10), 1333-1340.

  29. K. Fukae, N. Yamamoto, Y. Hatakeyama, Y. Kajihara; Chemoenzymatic synthesis of diverse asparagine-linked α -(2,3)-sialyloligosaccharides. Glycoconjugate J. (2004), 21(5), 243-250.