研究テーマ: 抗体と抗原の結合による超分 子構造の形成

生体高分子を用いた超分子合成およびその機能化

ある標的分子に特異的に、かつ強く結合する生体高分子「抗体」を利用した新規超分子の合成および高感度センシングシステムを開発しています。さらに抗体と人工の機能性低分子を融合した新しい機能性触媒やエネルギー変換材料を創製します。

新規抗体超分子

世界初  抗体を1ユニットとして合成された樹状超分子「抗体デンドリマー」(2003)
  "Antibody Dendrimer"

抗体IgM抗体を核に、化学修飾したIgG抗体を分岐として抗原抗体反応によって抗体を連結した新規樹状超分子を合成した。カチオン性ポルフィリンを免疫して得られた抗体IgMと、カチオン性ポルフィリンを修飾して得られた化学修飾抗体IgGを混ぜ合わせるとIgMがIgG上の抗原に結合し、「抗体デンドリマー」が得られる。本抗体超分子は分子量が200万を超える巨大分子集合体であり、非共有結合を介したデンドリマーである。抗体デンドリマーの構造を原子間力顕微鏡(AFM)により観察した結果、集合体の直径はIgMの約2倍で、外側に分岐が観測された。化学修飾抗体のみあるいはIgMのみではこのような集合体は見られなかったことから、混合溶液から得られたAFMイメージはIgMの周りにIgGが特異的に集積してできた超分子構造であると考えられる。この抗体デンドリマーの基質特異性は極めて高い。IgM、IgGおよび抗体デンドリマーの基質との親和性を酵素標識抗体測定法(ELISA)により調べた結果、抗体IgGに修飾したカチオン性ポルフィリンはIgMの結合部位に結合し、遊離の結合部位は 存在しないと考えられる。

Reported by C. J. Hawker et al. in J. Mater. Chem., 2003, 13, 2653-2660.

バイオセンサー材料

バイオセンサー基板上での超分子形成を利用した微量毒物検出 (2002)

ここではメチルビオロゲンの検出法について述べる。メチルビオロゲンは光化学における電子受容体としてよく用いられている。また除草剤としても用いられていた反面、パーキンソン病をひき起こす物質の一つとしても知られる有害物質である。メチルビオロゲンは電荷を有する低分子化合物であるため、SPR型バイオセンサーで特異的に微量検出することは分子量の点から困難である。また電荷を持つ分子は濃度が濃くなるとセンサー表面に非特異的吸着が起こるため、測定誤差が大きい。このメチルビオロゲンの検出にモノクローナル抗体を用いた。しかし抗メチルビオロゲン抗体を固定したセンサーチップ基板にメチルビオロゲンを添加したが、微量のメチルビオロゲンを検出することは困難であった。これは先に述べたようにメチルビオロゲンそのものの分子量が小さいためにバイオセンサーの応答シグナル強度が小さいことに起因する。メチルビオロゲンを特異的にかつ高感度で検出するためには抗体がメチルビオロゲンに結合したことを大きなシグナルとして取り出す必要がある。この問題を克服するシグナル増幅法の一つが抗体と2価性抗原との超分子形成である。2価性抗原とその抗原に相補的な抗体を等量ずつ混合すると、線状もしくは環状の会合体を形成する。 抗体を固定したセンサーチップに2価性抗原と抗体を順次添加するとSPRの応答シグナル強度は抗原-抗体間の会合体(超分子)の成長とともに増大する。ここで2価性抗原であるビ オロゲンダイマーの代わりにメチルビオロゲンを添加すると、センサーチップ上に固定された超分子の末端にある抗体の結合部位にメチルビオロゲンが結合し、ビオロゲンダイマ-と抗体の超分子形成ができなくなる。つまりビオロゲンモノマー(メチルビオロゲン)は超分子形成を阻害することになる。この手法においてメチルビオロゲン添加は次のステップの抗体―ビオロゲンダイマー間の超分子成長反応に影響を与える。メチルビオロゲンの分子量257の応答シグナル強 度は分子量15万の抗体の結合阻害挙動に置き換わることになる。
本システムの感度は低分子を抗体固定基板に添加する単純系の140倍になることがわかった。

触媒1

(1) 人工ポルフィリンー蛋白質錯体で最も効率の良い水素発生システムの構築 (2006)
Photoinduced Hydrogen Generation

Hydrogen Evolution System Using Antibody-Porphyrin-Complex as Photosensitizer

One of the complexes between monoclonal antibody 2B6 for porphyrin and zinc porphyrin (Zn-porphyrin) was used to construct an energy conversion system. The antibody 2B6 could bind Zn-porphyrin with a dissociation constant of 2.1 x 10-8 M, estimated by ELISA. When antibody 2B6 was added to an aqueous solution of Zn-porphyrin, the lifetime of its singlet exited state was lengthened from 1.7 to 2.1 ns. The triplet state lifetime of Zn-porphyrin was also lengthened from 0.5 to 1.2 ms.
Continuous light irradiation of Zn-porphyrin was performed in the presence of the antibody and MV. The color of the solution turned blue and a product with a maximum absorbance at 602 nm appeared. Methyl viologen cationic radical was obtained by the photoinduced electron transfer from porphyrin in the binding site of the antibody to MV. The half-life of methyl viologen cationic radical was over 15 min. No color changes were observed without antibodies. The antibody was found to catalyze the electron transfer to give a stable cationic radical. We found that the cationic radical obtained in the antibody?porphyrin complex system could be utilized for producing chemical energy, hydrogen. The antibody?porphyrin complex, MV, and colloidal Pt were equipped for the construction of a hydrogen evolution system. An increase of the concentration of hydrogen was observed in the solution of the antibody?porphyrin complex. The electron transfer could take place efficiently from porphyrin in the antibody binding site to MV outside of the binding pocket.

(2) 時として天然酵素に勝る触媒活性をもつ抗体ーポルフィリン錯体 (2004)
  Peroxidase Activity of Metalloporphyrin-Antibody Complex

An interesting development is the use of natural macromolecules as carriers for artificial catalysts. One example is the cationic meso-tetrakis(4-N-methylpyridyl)porphyrin and its analogues, which are known to bind to DNA. H. Yamaguchi and A. Harada (Osaka, Japan) bound the FeII complex of this porphyrin to the monoclonal antibody 12E11G. This macromolecular metal complex displays remarkable activity in the oxidation of catechol, guajacol, and pyrogallol in the presence of H2O2, and exhibits a peroxidase activity that lies in the same order as that of horseradish peroxidase while showing a better stability than the natural system.

Reported by Dieter Wohrle in Angew. Chem. Int. Ed., 2005, 44, 7500-7502.

触媒2

生体系に存在しない遷移金属錯体に対して作製された世界で初めての抗体 (2006)
抗体の厳密な分子認識能を利用した立体選択的水素化触媒 (2006)
Asymmetric Hydrogenation Catalyst

A highly selective catalyst that works like an artificial enzyme has been made using the molecule-targeting system that nature uses to combat infection.
The catalyst, an antibody-rhodium complex, was made by Akira Harada and colleagues at Osaka University, Japan. Harada says his new catalyst successfully combines the reactivity of rhodium with enzyme-like levels of selectivity. Although metals like rhodium, platinum and palladium form some of the most highly active catalysts used by chemists, enzymes with these metals in their active site are not found in nature. Artificial enzymes based on these metals could revolutionise catalysis, said Harada.
The researchers made the catalyst by treating immune system cells with a simple rhodium compound. This process triggers the cells to produce proteins called antibodies, which grab the compound as if it were an invading virus or bacteria. The antibody encloses the rhodium to form an asymmetric environment like an enzyme active site, which controls how substrates approach the metal to give the catalyst its selectivity.
Harada used the antibody-rhodium complex to try to reduce a carbon-carbon double bond in a series of amino acids precursors. The complex proved to be highly selective - only one of the precursors reacted, and only one of two possible enantiomers (mirror-images) of the amino acid product was formed.
The work was welcomed by Neil Thomas, an expert in catalytic antibodies at the University of Nottingham, UK. 'Harada's work provides one of the best examples of combining an organometallic catalyst with a bespoke protein cavity to create an asymmetric catalyst,' he said.
The next challenge is to design a binding site for substrates for which it is difficult to obtain enantiopure products using traditional chiral transition metal catalysts, said Harada.

Reported by Prof. Dr. James Mitchell Crow, in Chemical Science (Royal Society of Chemistry)

ポルフィリンの科学-人工光合成を目指して-

(a)ポルフィリンに対する抗体の機能と構造との相関 (2000)

Angew. Chem. Int. Ed.,2000, 39, 3829-3831.

(b)異種ポルフィリン間での星型超分子結晶形成 (2001) 

DNA超分子

走査型プローブ顕微鏡で見る超分子構造(2000)

環状DNAの絡み合い分子(DNAカテナン)そのものをAFMで観察した初めての例

環状DNAから調製した「DNAカテナン」     環状DNAモノマー

近年、2個以上の環状化合物が互いに「知恵の輪」のように連結している化合物「カテナン」に多大の関心が寄せられている。これはカテナンが粘弾性に富む材料や新規刺激応答材料としての機能発現が期待できるからである。カテナンの構成ユニットに生体高分子を用い、それらを人工的に組織化・集積化することができれば、生体高分子の本来の機能に新たな機能を付与することが可能になると期待される。本研究では、高度な情報を担うDNAを超分子構造形成のための材料として注目した。本トピックスでは環状DNAを非共有結合で連結したDNAカテナンの構造観察について述べる。

市販のプラスミドDNA(環状DNA、pBR322)は溶液中、開環状(弛緩した輪)と閉環状(1分子内でDNA2本鎖同士が巻き付いた構造)DNAに起因する2種類の構造が存在する。電気泳動で分離された2つのバンドからそれぞれDNAを 抽出し、原子間力顕微鏡(AFM)測定を行った。AFM測定はシリコン単結晶の探針を用いて、タッピングモードで大気中室温において行った。その結果、視野内すべてのDNA分子イメージが開環状あるいは閉環状構造になっていることがわかった。これは電気泳動バンドから抽出された溶液中のDNA構造がAFM測定時においても保持されていることを示している。

プラスミドDNAにDNase Iを添加することにより閉環状DNAを開環状構造体に変化させた。ここにトポイソメラーゼIを添加した結果、新たな電気泳動バンドが現れた。このバンドから抽出されたDNAのAFMイメージでは鎖長がDNAモノマーの鎖長(約1.5 μm)の2倍で、かつDNA鎖が絡み合ってカテナン構造を形成していることがわかった。