研究テーマ: 抗体と抗原の結合による超分子構造の形成

生体高分子を用いた超分子合成およびその機能化

ある標的分子に特異的に、かつ強く結合する生体高分子「抗体」を利用した新規超分子の合成および高感度センシングシステムを開発しています。さらに抗体と人工の機能性低分子を融合した新しい機能性触媒やエネルギー変換材料を創製します。

超分子形成

抗体デンドリマー:抗体を1ユニットとして合成された樹状超分子(2003)

抗体IgM抗体を核に、化学修飾したIgG抗体を分岐として抗原抗体反応によって抗体を連結した新規樹状超分子を合成した。カチオン性ポルフィリンを免疫して得られた抗体IgMと、カチオン性ポルフィリンを修飾して得られた化学修飾抗体IgGを混ぜ合わせるとIgMがIgG上の抗原に結合し、「抗体デンドリマー」が得られる。本抗体超分子は分子量が200万を超える巨大分子集合体であり、非共有結合を介したデンドリマーである。抗体デンドリマーの構造を原子間力顕微鏡(AFM)により観察した結果、集合体の直径はIgMの約2倍で、外側に分岐が観測された。化学修飾抗体のみあるいはIgMのみではこのような集合体は見られなかったことから、混合溶液から得られたAFMイメージはIgMの周りにIgGが特異的に集積してできた超分子構造であると考えられる。この抗体デンドリマーの基質特異性は極めて高い。IgM、IgGおよび抗体デンドリマーの基質との親和性を酵素標識抗体測定法(ELISA)により調べた結果、抗体IgGに修飾したカチオン性ポルフィリンはIgMの結合部位に結合し、遊離の結合部位は 存在しないと考えられる。

Harada, A.; Yamaguchi, H.; Tsubouchi, K.; Horita, E. Chem. Lett. 2003, 32, 18–19.

DNA カテナンの直接観察:環状DNAの絡み合い分子をAFMで観察した初めての例(2000)

環状DNAから調製した「DNAカテナン」     環状DNAモノマー

近年、2個以上の環状化合物が互いに「知恵の輪」のように連結している化合物「カテナン」に多大の関心が寄せられている。これはカテナンが粘弾性に富む材料や新規刺激応答材料としての機能発現が期待できるからである。カテナンの構成ユニットに生体高分子を用い、それらを人工的に組織化・集積化することができれば、生体高分子の本来の機能に新たな機能を付与することが可能になると期待される。本研究では、高度な情報を担うDNAを超分子構造形成のための材料として注目した。本トピックスでは環状DNAを非共有結合で連結したDNAカテナンの構造観察について述べる。

市販のプラスミドDNA(環状DNA、pBR322)は溶液中、開環状(弛緩した輪)と閉環状(1分子内でDNA2本鎖同士が巻き付いた構造)DNAに起因する2種類の構造が存在する。電気泳動で分離された2つのバンドからそれぞれDNAを 抽出し、原子間力顕微鏡(AFM)測定を行った。AFM測定はシリコン単結晶の探針を用いて、タッピングモードで大気中室温において行った。その結果、視野内すべてのDNA分子イメージが開環状あるいは閉環状構造になっていることがわかった。これは電気泳動バンドから抽出された溶液中のDNA構造がAFM測定時においても保持されていることを示している。

プラスミドDNAにDNase Iを添加することにより閉環状DNAを開環状構造体に変化させた。ここにトポイソメラーゼIを添加した結果、新たな電気泳動バンドが現れた。このバンドから抽出されたDNAのAFMイメージでは鎖長がDNAモノマーの鎖長(約1.5 μm)の2倍で、かつDNA鎖が絡み合ってカテナン構造を形成していることがわかった。

Yamaguchi, H.; Kubota, K.; Harada, A. Chem. Lett. 2000, 29, 384–385.

カチオン性 / アニオン性ポルフィリン間での星型超分子結晶形成 (2001) 

アニオン性のポルフィリン(Tetrasodium [meso-tetrakis(4-sulfonatophenyl)por-phinato]zinc, Zn-TSPP) とカチオン性のポルフィリン (meso-tetrakis(4-(trimethylammo-nio)phenyl)porphine tetratosylate, TTMAPP) を DMSO 中で混合すると星型の超分子構造が形成されることを発見した。TTMAPP の代わりにmeso-tetrakis(N-methylpyridinium-4-yl)porphine p-toluenesul-fonate (TMPyP) を用いるとこのような構造が得られなかった。種々の実験結果から星型の超分子構造形成にはポルフィリン上の電荷の位置や置換基の構造、溶媒分子などが影響していることがわかった。イオン性ポルフィリンの組み合わせを変化させることによってメソスケールの超分子構造を制御することが可能になった。

Yamaguchi, H.; Harada, A. Chem. Lett. 2001, 30, 778–779.

エネルギー変換

ポルフィリンに対する抗体の機能と構造との相関 (2000)

ポルフィリンの軸上にテレフタル酸を結合した化合物に対するモノクローナル抗体を5種作製した。そのうちの1種、74D7A は免疫に用いたポルフィリンのみならずテレフタル酸に対しても選択的に結合した。さらにこの抗体は電子ドナーであるポルフィリンと電子アクセプターであるテレフタル酸を同時に結合することにより、光誘起電子移動反応を加速した。

Yamaguchi, H.; Kamachi, M.; Harada, A. Angew. Chem. Int. Ed.,2000, 39, 3829-3831.

人工ポルフィリンータンパク質錯体で最も効率の良い水素発生システムの構築 (2006)

水溶性の合成ポルフィリン (テトラカルボキシフェニルポルフィリン, TCPP) に結合するモノクローナル抗体を数種類得た。そのうちの1種、抗体 2B6 は TCPP のみならずその亜鉛錯体 (Zn-TCPP) とも錯体を形成することがわかった。抗体-Zn-TCPP 錯体に電子アクセプターとしてメチルビオロゲン (MV2+) を添加すると、Zn-TCPP から MV2+ への光誘起電子移動が促進され、安定な電子移動生成物 (ラジカルカチオン種) が得られることを見出した。このポルフィリン-抗体錯体を光増感剤として用い、白金コロイド存在下、新規水素発生システムを構築することができた。

Onji, T.; Ohara, H.; Yamaguchi, H.; Ikeda, N.; Harada, A. Chem. Lett. 2006, 35, 1126–1127.
Yamaguchi, H.; Onji, T.; Ohara, H.; Ikeda, N.; Harada, A. Bull. Chem. Soc. Jpn. 2009, 82, 1341–1346. (BCSJ Award Article)

バイオセンシング

バイオセンサー基板上での超分子形成を利用した微量毒物検出 (2002)

ここではメチルビオロゲンの検出法について述べる。メチルビオロゲンは光化学における電子受容体としてよく用いられている。また除草剤としても用いられていた反面、パーキンソン病をひき起こす物質の一つとしても知られる有害物質である。メチルビオロゲンは電荷を有する低分子化合物であるため、SPR型バイオセンサーで特異的に微量検出することは分子量の点から困難である。また電荷を持つ分子は濃度が濃くなるとセンサー表面に非特異的吸着が起こるため、測定誤差が大きい。このメチルビオロゲンの検出にモノクローナル抗体を用いた。しかし抗メチルビオロゲン抗体を固定したセンサーチップ基板にメチルビオロゲンを添加したが、微量のメチルビオロゲンを検出することは困難であった。これは先に述べたようにメチルビオロゲンそのものの分子量が小さいためにバイオセンサーの応答シグナル強度が小さいことに起因する。メチルビオロゲンを特異的にかつ高感度で検出するためには抗体がメチルビオロゲンに結合したことを大きなシグナルとして取り出す必要がある。この問題を克服するシグナル増幅法の一つが抗体と2価性抗原との超分子形成である。2価性抗原とその抗原に相補的な抗体を等量ずつ混合すると、線状もしくは環状の会合体を形成する。 抗体を固定したセンサーチップに2価性抗原と抗体を順次添加するとSPRの応答シグナル強度は抗原-抗体間の会合体(超分子)の成長とともに増大する。ここで2価性抗原であるビ オロゲンダイマーの代わりにメチルビオロゲンを添加すると、センサーチップ上に固定された超分子の末端にある抗体の結合部位にメチルビオロゲンが結合し、ビオロゲンダイマ-と抗体の超分子形成ができなくなる。つまりビオロゲンモノマー(メチルビオロゲン)は超分子形成を阻害することになる。この手法においてメチルビオロゲン添加は次のステップの抗体―ビオロゲンダイマー間の超分子成長反応に影響を与える。メチルビオロゲンの分子量257の応答シグナル強 度は分子量15万の抗体の結合阻害挙動に置き換わることになる。
本システムの感度は低分子を抗体固定基板に添加する単純系の140倍になることがわかった。

Yamaguchi, H.; Harada, A. Biomacromolecules, 2002, 3, 1163–1169.

爆発物質を特異的に検出できるモノクローナル抗体の作製 (2013)

爆発物の一つでる過酸化アセトン (TATP) に結合するモノクローナル抗体を作製した。TATP と化学構造が類似する安定なスピロ環化合物を抗原決定基に用いることにより抗TATP抗体を作製することに成功した。表面プラズモン共鳴法を検出原理とするバイオセンサーにおいて本抗体を利用すると、μM レベルのTATPを検出することができた。

Matsumoto, T.; Yamaguchi, H.; Kamijo, K.; Akiyoshi, M.; Matsunaga, T.; Harada, A. Bull. Chem. Soc. Jpn. 2013, 86, 198–202. (BCSJ Award Article)

機能性超分子触媒

抗体ーポルフィリン錯体による基質選択的な過酸化反応 (1997)

アニオン性ポルフィリン (meso-tetrakis(4-carboxyphenyl)porphyrin, TCPP)に対して作製された抗体 03-11-3はTCPPのMn錯体 (MnIII-TCPP) や Fe 錯体 (FeIII-TCPP) に対しても結合した。天然の過酸化酵素の1種である西洋わさびペルオキシダーゼ (HRP) は様々な基質に対して触媒活性を示すのとは対照的に、抗体 03-1- FeIII–TCPP 錯体は基質としてピロガロールを用いた場合にのみ過酸化反応を触媒した4

(1) Harada, A.; Okamoto, K.; Kamachi, M.; Honda, T.; Miwatani, T. Chem. Lett. 1990, 19, 917–918.
(2) Harada, A.; Okamoto, K.; Kamachi, M. Chem. Lett. 1991, 20, 953–956.
(3) Harada, A.; Shiotsuki, K.; Fukushima, H.; Yamaguchi, H.; Kamachi, M. Inorg. Chem. 1995, 34, 1070–1076.
(4) Harada, A.; Fukushima, H.; Shiotsuki, K.; Yamaguchi, H.; Oka, F.; Kamachi, M. Inorg. Chem. 1997, 36, 6099–6102.

時として天然酵素に勝る触媒活性をもつ抗体ーポルフィリン錯体 (2004)

カチオン性ポルフィリン (5-(4-carboxyphenyl)-10,15,20-tris(4-methylpyri-dyl)porphine iodide, 3MPy1C) に対して作製された抗体 12E11G はtetramethylpyridylporphyrin ironcomplex (FeIII–TMPyP) に対しても結合した。抗体12E11G- FeIII–TMPyP 錯体はピロガロール、カテコール、グアイアコールの酸化反応を触媒した。このカチオン性ポルフィリン-抗体の錯体はアニオン性ポルフィリン-抗体の系よりも高い触媒活性を示しただけでなく、天然の過酸化酵素の1種である HRP が触媒活性を低下させるような高濃度の過酸化水素存在下においても触媒活性を維持した。

Yamaguchi, H.; Tsubouchi, K.; Kawaguchi, K.; Horita, E.; Harada, A. Chem. Eur. J. 2004, 10, 6179–6186.

生体系に存在しない遷移金属錯体に対して作製された世界で初めての抗体 (2006)
抗体の厳密な分子認識能を利用した立体選択的水素化触媒 (2006)

生体内には存在しない遷移金属錯体 (アキラルなロジウム錯体) に対して特異的に結合するモノクローナル抗体を作製し、得られた抗体とロジウム錯体との複合体の機能を検討した。抗体とロジウム錯体との複合体を含む水溶液にアラニン前駆体である2-アセトアミドアクリル酸を基質として添加した。この溶液に水素をバブリングし、37 ℃で12時間反応させた後、キラルHPLCおよびGCにおいて反応生成物を分析した。抗体非存在下ではN-アセチルアラニンのラセミ体が得られるのに対して、抗体存在下ではL体が精製していることがわかった。抗体の結合によりロジウム錯体の触媒能は向上した。本抗体はロジウム錯体と水溶液中で安定な錯体を形成し、基質特異性を有する極めて厳密な不斉水素化触媒となることが明らかになった。

Yamaguchi, H.; Hirano, T.; Kiminami, H.; Taura, D.; Harada, A. Org. Biomol. Chem. 2006, 4, 3571–3573.

機能性超分子材料

光照射によって ON / OFF 制御可能なヒドロゲル集積システム

光応答性を有するアゾベンゼン (Azo) とシクロデキストリン (CD) をそれぞれ導入したヒドロゲルを用いて、光照射でゲルを接着・解離させることができるシステムを開発した。α-CD ゲル、β-CD ゲル、trans-Azo ゲルを水中にて同時に震とうすると、α-CD ゲルが選択的に trans-Azo ゲルと接着した。α-CD ゲルと trans-Azo ゲルの集合体に 365 nm の光を照射後。振とうするとAzo ゲルに接着していた α-CD ゲルが解離し、代わりに β-CD ゲルが Azo ゲルと選択的に接着することがわかった。光照射でゲルの集積を ON / OFF 制御するとともに、接着する相手をスイッチできるシステムを開発することに成功した。

Yamaguchi, H.; Kobayashi, Y.; Kobayashi, R.; Takashima, Y.; Hashidzume, A.; Harada, A. Nat. Commun. 2012, 3, 603.

鉄ポルフィリンとヒスチジンの配位結合を利用したヒドロゲル集積システム

ヘモグロビン、ペルオキシダーゼやシトクロム等では、タンパク質が補因子として複合体を作ることでそれぞれの酸素運搬、酸化還元酵素、電子伝達等の機能を発現している。金属ポルフィリンの金属部位にタンパク質などの特定のアミノ酸が配位し、その配位結合の強さを調整することでこれらの機能を発現する。本研究では、金属ポルフィリンとアミノ酸をそれぞれ導入したゲルを合成し、これらのヒドロゲルを配位結合による集積することが可能なシステムを構築した。

鉄ポルフィリン (Fe-Por) とL-ヒスチジン (L-His) をそれぞれポリアクリルアミドゲルに導入した。Fe-Por ゲルと L-His ゲルを緩衝液中で振動すると、接触と同時に2種類のゲルが接着・集積した。Fe-Por ゲル同士あるいはL-His ゲル同士ではこのようなゲルの接着は見られなかった。Fe-Por ゲルと L-His ゲルの集積体に L-His の水溶液を添加すると、個々のゲルに解離した。これらのゲルを洗浄すると再びゲルが自己集積した。このゲル着脱はpH 応答性を示し、pH 9.0 では接着、pH 2.0 では解離する。フリーベースポルフィリン (2H-Por) のゲルは L-His ゲルと接着しないが、2H-Por に鉄を導入する反応を行うと L-His ゲルと接着することがわかった。Fe-Por と L-His の金属-配位子間相互作用によってゲルが接着していることがわかった。鉄の代わりに亜鉛が配位した Zn-Por のゲルも合成し、Fe-Por、Zn-Por、L-His の3種ゲルを同時に振動すると、L-His ゲルは強く配位する Fe-Por ゲルとのみ特異的に集積体を形成した。

Kobayashi, Y.; Takashima, Y.; Hashidzume, A.; Yamaguchi, H.; Harada, A. Sci. Rep. 2013, 3, 1243.

アポタンパク質導入ゲルと補因子固定ゲルとの接着現象を利用した触媒活性制御

ヘム酵素の一つである西洋わさびペルオキシダーゼ (HRP) から補因子 (FePor) を抜き出したアポタンパク質 (apoHRP) と FePor をそれぞれポリアクリルアミドゲル (pAAm ゲル) に導入した。apoHRP ゲルとFePor ゲルを4 ℃で接触させたところ、ゲルが接着した。種々の比較実験より、これらのゲルの接着が apoHRP と FePor の錯体形成に基づいていることが示唆された。apoHRP ゲルと FePor ゲル存在下、HRP の基質となる 2,2'-azino-bis(3-ethyl benzothiazoline-6-sulphonic acid) (ABTS) の酸化反応を観察した。apoHRP ゲルと FePor ゲルを接着させると ABTS の酸化反応速度が加速された。これに対し、apoHRP ゲルと PAAm ゲル、pAAm ゲルと FePor ゲルの組み合わせではこのような酸化反応は起こらなかった。ABTS の酸化反応速度は apoHRP 及び FePor ゲルの導入量および2種のゲルの接着面積に比例することがわかった。apoHRP ゲルと FePor ゲルを接着させると ABTS の酸化反応が加速され、離すと反応が進行しなくなった。2種類のゲルの接着-解離によって触媒反応を制御できることがわかった。

Kobayashi, Y.; Takashima, Y.; Hashidzume, A.; Yamaguchi, H.; Harada, A. Sci. Rep. 2015, 5, 16254.

最近の研究

ドナー-アクセプター (DA) 相互作用によって架橋された超分子材料の力学特性

ピレン (py) とトリニトロベンゼン (TNB) を同一の主鎖に導入した高分子を合成した。この高分子をDMSOに溶解後、乾燥させることによって DA エラストマーを得た。DA エラストマーの破壊エネルギーは共有結合で架橋されたエラストマーよりも3倍高かった。走査速度を変化させて引張試験を行ったところ、DA エラストマーは 1 mm / s の引張速度においては 0.1 mm / s のときよりも13倍高い破壊エネルギーを示した。比較対象である共有結合で架橋されたエラストマーの破壊エネルギーは引張速度に依存しなかった。これらの結果は低い引張速度のときはDA 錯体が徐々に解離するのに対し、速い引張速度の際は一度に多数のDA錯体が解離させられることに起因していると考えられる。DA相互作用という弱い非共有結合を用いることにより引張速度によって材料強度を変化させる超分子材料を創製することに成功した。

Itano, M.; Kobayashi, Y.; Takashima, Y.; Harada, A.; Yamaguchi, H. Chem. Commun. 2019, Advance Article (DOI: 10.1039/C9CC01472A)

ラセミ体の軸不斉型ビナフチル化合物を用いた免疫によるキラル認識抗体の作製 (2019)

Under Construction

Adachi, T.; Odaka, T.; Harada, A.; Yamaguchi, H. submitted

抗ビナフチル抗体を用いた簡便かつ迅速な光学分割手法の構築 (2017)

抗ビナフチル抗体をキラルセレクターとして利用した。 ビナフチル誘導体のラセミ体 (BN (rac)) と抗ビナフチル抗体を混合して限外ろ過を行うと低分子量成分には高い光学純度の BN が含まれた。抗 BN (R) 抗体と抗 BN (S) 抗体を使い分けることにより、簡便な操作によって両方のエナンチオマーを精製することができた。抗体のクロマトグラフィー担体への固定化などを必要とせずに抗体を直接使用することができる新たな光学分割の方法論を開発することに成功した。

Adachi, T.; Odaka, T.; Harada, A.; Yamaguchi, H. ChemistrySelect 2017, 2, 2622–2625. (Cover Picture)

抗ビナフチル抗体と熱応答性高分子を用いたキラル可視化システムの構築 (2017)

ビナフチル誘導体の S 体 (BN (S)) をポリ N-イソプロピルアクリルアミドの中央部にリンカーを介して導入した pNIPAM-BN (S) と抗 BN (S) 抗体を混合すると、その溶液の下限臨界溶液温度 (LCST) が pNIPAM-BN (S) のみの系よりも高くなる挙動を見出した。一方、BN (R) を導入したポリマー pNIPAM-BN (R) に抗 BN (S) 抗体を添加してもその LCST は変わらなかった。pNIPAM 中の BN にモノクローナル抗体が結合することにより pNIPAM の凝集挙動が変化することがわかった。抗 BN (S) 抗体存在下、pNIPAM-BN (S) の水溶液に BN (R) そのものを添加しても水溶液の状態に変化は見られないが、BN (S) を混合すると再び溶液が白濁した。抗体に結合する相手が pNIPAM 中の BN (S) から遊離の BN (S) に組み変わることで再び元の pNIPAM-BN (S) の凝集が起こったと考えられる。熱応答性高分子を利用して抗体のキラル認識を可視化することができた。

Odaka, T.; Adachi, T.; Harada, A.; Yamaguchi, H. Chem. Lett. 2017, 46, 1173–1175. (Editor's Choice)

抗ビナフチル抗体とビイソキノリン型金属錯体の超分子錯体を用いた触媒的不斉C-C結合形成 (2019)

Under Construction

Adachi, T.; Odaka, T.; Harada, A.; Yamaguchi, H. submitted